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高效液相色谱法测定雷替曲塞的含量及有关物质

作者：杨士军靳玉红

更新时间：2012-11-12

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（河南天方药业股份有限公司河南驻马店 463003）
张勇（河南省驻马店市质量技术监督检测中心河南驻马店 463000）
［摘要］本文探讨了采用高效液相色谱法测定雷替曲塞的含量及有关物质，方法简便、浓度范围宽、线性好、准确度高、精密度和重复性均较好。
［关键词］雷替曲塞 R-对映异构体含量测定合成
雷替曲塞（Raltitrexed）是由英国Astra Zeneca制药公司研制开发并于1996年首先在英国上市的一种喹唑啉叶酸类似物，临床上用于治疗晚期结肠、直肠癌。这些多聚谷氨酸类化合物是比雷替曲塞更强的胸腺嘧啶合成酶抑制剂，并能在细胞内潴留，长时间地发挥抑制作用，可以显著提高结直肠癌患者的生存质量。因此，在英国等西欧国家，雷替曲塞已替代5-氟尿嘧啶成为晚期结肠、直肠癌一线治疗的黄金药物。
化学原料药的含量测定以及对其进行的有关物质检查是评价药品质量的主要指标之一。为了严格控制雷替曲塞的产品质量，有效控制雷替曲塞的光学纯度，根据《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则》和《中国药典》2000年版二部中有关要求，我们用高效液相色谱法对雷替曲塞的含量测定以及有关物质检查进行了研究。R-对映异构体杂质的检测方法研究中所用R-对映异构体，用D-谷氨酸替代L-谷氨酸按合成雷替曲塞的方法制备得到。
一、材料与方法
1 、仪器与试药。高效液相色色谱仪由日本岛津Agilent 1100 高效液相色谱仪（包括二极管阵列检测器）；雷替曲塞对照品（河南天方药业股份有限公司药物研究所，批号为000527，含量100.0% ），雷替曲塞样品（河南天方药业股份有限公司药物研究所，批号分别为010802、010803、010804），乙腈（色谱纯），磷酸二氢钠（分析纯），磷酸氢二钠（分析纯）。
2、实验方法
（1）色谱条件。流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠液—0.05mol/L磷酸氢二钠液—乙腈（80：5：15）
色谱柱：SB-C18，150×4.6mm，5μ；检测波长：348nm；柱温：30℃；流速：0.6ml/min；进样量：20 ul。
（2）方法的专属性。采用上述方法分别对雷替曲塞对照品流动相溶液以及雷替曲塞对照品经碱、酸、氧化、强光、高温破坏处理后进行检测，对雷替曲塞样品流动相溶液、中间体（L-氨基物、L-N甲基物、雷替曲塞二乙酯）流动相溶液以及雷替曲塞中加以上各中间体后进行检测。结果显示，强制破坏性试验产生的各杂质峰与主成份峰的分离度均大于1.5，符合规定要求。用二极管阵列检测器对上述各溶液的色谱图中各中间体峰在190-400nm波长范围内进行紫外光谱扫描并记录最大吸收波长，每个中间体在348nm波长附近都有最大吸收，其响应值基本一致。
（3）线性关系。精密称取雷替曲塞对照品52mg于50ml容量瓶中，加入适量流动相使溶解后，用流动相稀释至刻度摇匀，作为标准贮备液。分别精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于5个50 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。照上述色谱条件，分别精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，建立标准曲线，并进行线性回归，得线性回归方程Y=3831X－8.8349，其中X为浓度（g/ml），Y为峰面积（mAU*sec），相关系数r＝1。表明雷替曲塞在20. 8g/ml～104g/ml浓度范围内具有良好的线性。
（4）最小检测限。取雷替曲塞用流动相制成每1ml中约含雷替曲塞0.4mg的溶液作为供试品溶液，然后用流动相分别稀释100、1000、2000倍，得测试溶液Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ，分别取Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ各20l(分别相当于供试品溶液中主成分的1%、0.1%、0.05％)进样分析，记录色谱图。
从色谱图可知，测试溶液Ⅲ的主成分色谱峰峰高约为基线噪音的3倍，即信噪比S/N=3时，最小检出量为1ng 雷替曲塞，方法的灵敏度符合测定雷替曲塞杂质限量的要求。
（5）精密度实验。以雷替曲塞对照品为考察对象，采用保留时间和峰面积为指标，对同一个样品连续测定6次，分别计算保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.32%、0.15%。
（6）回收率实验。取本品用流动相溶解并稀释得到三个浓度的样品（正常浓度的80%、100%和120%），再分别加入对照品溶液，稀释定容，摇匀后进样分析。所得到的数据按下式求出对应的回收率。回收率= （A加标－A样）／A标×100。所计算出的回收率为100.6%
（7）重复性试验。以010802号样品为对象，称取3份样品，按上述方法制配样品，进样分析，每个样品进三次，算出相对标准偏差（RSD）的结果为0.05%（n=9）。
（8）雷替曲塞有关物质测定。雷替曲塞中有关物质主要有合成过程中带入的原料、中间体、副反应产物，贮存过程中可能产生的降解产物。取本品用流动相制成每1ml中约含雷替曲塞0.4mg的溶液作为供试溶液，精密量取适量，用流动相制成每1ml中约含雷替曲塞0.004mg的溶液作为对照溶液，按上述色谱条件，分别精密量取供试溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。供试溶液色谱图中如显杂质峰，各杂质峰面积之和不得大于对照溶液的主峰面积（1.0%）。由测试结果可知，几批样品的有关物质均小于1.0 %。
（9）含量测定。取本品适量，精密称定，用流动相制成80g /ml的溶液作为供试液，照上述色谱条件，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，另取雷替曲塞对照品同法测定，按外标法（扣除对照品水分）以峰面积计算即得。三批样品含量测定结果见表3.1及色谱图3.19～图3.22。
二、结果
1、有关物质检查。取本品用流动相制成每1ml中约含雷替曲塞0.4mg的溶液作为供试溶液，精密量取适量，用流动相制成每1ml中约含雷替曲塞0.004mg的溶液作为对照溶液，按上述色谱条件，分别精密量取供试溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。供试溶液色谱图中如显杂质峰，各杂质峰面积之和不得大于对照溶液的主峰面积（1.0%）。由测试结果可知，几批样品的有关物质均小于1.0 %。
2、含量测定。取本品适量，精密称定，用流动相制成80g /ml的溶液作为供试液，照上述色谱条件，精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，另取雷替曲塞对照品同法测定，按外标法（扣除对照品水分）以峰面积计算即得。
三、讨论
1、检测波长的确定。取雷替曲塞对照品和样品各一份，加流动相制成0.4mg/ml的溶液，在200~450nm范围内进行光谱扫描，结果在226nm和348nm处有最大吸收，故选择348nm作为有关物质测定波长。
2、流动相的选择。用三个浓度（0.0mol/L、0.01mol/L、0.05mol/L）的磷酸二氢钠缓冲溶液与乙腈混合体系进行试验，结果发现不加磷酸二氢钠主峰色谱图形拖尾严重，后改为0.05mol/L NaH2PO4—0.05mol/L Na2HPO4—乙腈（80：5：15）为流动相，此时峰形较对称，理论板数及分离度较好。
3 、不同型号色谱柱验证。实验中选择了Hypersil 和用Licrosorb两种牌号的色谱柱进行对比，供试品的主峰的峰型及与杂质的分离情况看，只要是有足够分离度的色谱柱均能采用本方法进行分析。
本法具有浓度范围宽、线性好、准确度高、精密度和重复性均较好的特点，可以用来测定雷替曲塞的含量。
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